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CRISPR基因编辑及其应用

来源:??????2015-05-09 15:44:17??????点击:
前不久我国科学家发表了一篇探讨CRISPR基因编辑技术在人类胚胎突变基因修复中的可能应用的研究论文,引发了全球关于该技术的安全性及相关应用的伦理大讨论。一些科学家认为该技术还不成熟,所以安全性问题极大。另一些科学家认为我们走的太快,还没有足够的时间来思考这一技术在生殖细胞(精子和卵子)及胚胎应用的可能伦理性问题。美国国立卫生院随即决定暂不批准任何利用CRISPR基因编辑技术在人类胚胎中的研究项目。由于全球媒体的聚焦,可能也会迫使我国相关科研和卫生部门对这一问题重视起来。所以,我们有必要从科学的角度,重新回顾一下这个技术为何如此重要?

自从华生和克里克提出了DNA的双螺旋结构,科学家意识到了DNA的碱基序列编码了所有生命体的遗传信息。在过去的60余年中,生物学研究的主旋律就是对DNA序列的解析、认识及改造。上世纪70年代建立起来的分子克隆技术使我们可以快速构建可以用于表达特定基因的载体,1977年Sanger发明的快速测定DNA序列方法让我们有可能系统分析基因序列。到现代高通量测序技术和1977年Sanger测序技术相比,测定一个完整的人类基因组的序列的价格相差了3百多万倍。1983年Mullis发明的PCR技术使我们能快速合成大量的DNA片段,万事具备,我们现在最大期望,就是发展一个好的技术可以精确的改造我们的基因组DNA,这样我们在理论上实际上就有可能修复很多由于遗传突变带来的疾病。当然,我们也可能通过基因组改造让我们的下一代变得更加“聪明”或“健康”,就像我们在科幻电影中看到的一样。

上世纪80年代,Capecchi, Evans and Smithies 三位科学家发明了在小鼠胚胎干细胞中利用DNA同源重组精确改造基因组的技术,由于干细胞可以整合到小鼠胚胎中并分化成生殖细胞,因此基因组的特定修饰和改造可以遗传到下一代。这一技术(也称为基因打靶技术)使我们能够系统分析小鼠基因的功能,并借助小鼠编码基因和人类编码基因之间的近90%的同源性来推断人类编码基因的功能。但是,人类干细胞的全能性由于伦理问题无法利用人类胚胎进行验证,而目前的状况是只有小鼠的胚胎干细胞可以到达可以系统性开展基因组修饰的效率。

在等待了近60年后,新的基因组改造和修饰技术在2010年“突然”出现了。利用不同的机制,科学家将核酸内切酶导向到基因组的特定位点,核酸内切酶将DNA剪切,靶DNA双链发生断裂,启动自然界普遍存在的DNA非同源末端链接途径修复,和同源重组修复,实现DNA序列改变,为区别于80年代发明的基因打靶技术,我们将新的技术称之为基因编辑技术。

这类技术主要包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9三大基因编辑技术。编辑工具的共同点是:含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域,其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA,而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复,DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。

ZFN的基因修饰是针对某些特定的碱基序列来设计ZFN实现靶基因的修饰,其最明显的局限性是ZFN的识别结构域中存在上下序列的依赖效应,使得ZFN设计和筛选效率大大降低,只能达到30%左右基因修饰效率。由于目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN,也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点,因此在ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术困难。另外,由于ZFN的脱靶切割会导致细胞毒性,使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。
相比ZFN技术,TALEN使用了TALE分子代替ZF作为人工核酸酶的识别结构域,极好地解决了ZF对于DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与DNA碱基是一一对应的,并且对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定,使得其设计相对于ZFN的设计要简单得多。但是在构建过程中,TALE分子的模块组装和筛选过程比较繁杂,需要大量的测序工作。

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,广泛存在于众多原核生物基因中,其中II型为CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割,形成双链DNA缺口,然后细胞会借助同源重组机制或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复,造成基因敲除或敲入效果。

相较于ZFN和TALEN两种人工核酸酶技术,CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原核生物RNA干扰系统,具有如下优势:

1)其介导的基因组编辑是由向导RNA指导的,对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程,比蛋白质对DNA序列的识别要精确更多,降低了脱靶切割的几率,减低了细胞毒性;

2)CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互补的向导RNA即可,过程相对于TALEN更为简单和廉价,普通的实验室也可以自行完成构建,这大大提高了基因操作的效率和速度;

3)由于进行切割的Cas9蛋白是通用的核酸内切酶,Cas9的靶向可以通过一小段与靶序列互补的向导RNA实现,因此,可以通过同时导入多个向导RNA,同时实现多个基因的修饰。并可以通过高通量制备向导RNA,进行高通量的基因修饰。

CRISPR/Cas9系统的特点,已经使得其成为了基因编辑领域最新,但发展最快、应用最广的技术,引发了基因编辑领域的革命。现在CRISPR/Cas9系统已经被成功地用来DNA敲除、DNA敲入、DNA替代、DNA修饰、RNA修饰、DNA标记、基因转录调节等,使得该系统被广泛地应用于不同的领域。

在动物模型构建领域,由于传统基因工程技术只适于制备基因工程小鼠,因而小鼠成为了最被广泛使用的模式动物。不过,利用传统的基因工程操作技术进行基因工程小鼠的制备周期长(需要1-2年)、费用高(制备全身性基因敲除小鼠需10万人民币,基因敲入或条件性基因敲除小鼠需15万人民币),极大地制约了基因工程小鼠模型的生产和应用。利用CRISPR/Cas9系统构建小鼠模型,将成本和和时间降低80%以上,极大地改良基因工程小鼠的制备,从而极大地推广基因工程小鼠的应用。不仅如此,该技术还使得其它种类的基因工程动物制备成为可能。比如,由于进化相近和生理特征相似,基因敲除猴模型被公认为是模拟人类疾病的最好的动物模型,但由于技术的限制,一直以来不能制备。CRISPR/Cas9的应用解决了这一难题。

在物种改造领域,该技术可以通过引入一些基因突变而实现家畜和粮食优良性状的形成。人们一直在千方百计进行育种以期得到由基因改变导致优良性状的新品种。但是,由于这样的基因改变是在长期的进化过程中发生的,通过自然筛选育种得到自然发生的带有基因突变的优良品质非常困难。CRISPR/Cas9高效基因修饰使得通过人工改良实现自然突变从而得到优良品种成为可能。比如,自然界中存在一些MSTN基因突变导致的双臀肌羊。因此,人们期待通过人工改变MSTN基因,实现自然界中存在的MSTN突变,得到肌肉含量高的家畜。利用CRISPR/Cas9制备出来的山羊,增重20%以上。

CRISPR/Cas9技术最有潜力的应用是医学应用。基因治疗是多年来人类治疗遗传疾病的梦想,但一直受限于基因修复技术。利用CRISPR/Cas9技术科学家对引起小鼠白内障遗传疾病的Crygc基因突变进行修复,成功治愈了小鼠白内障,CRISPR/Cas9技术的应用使得人类遗传病治疗的成为可能。因为艾滋病病毒的基因组已经整合到病人细胞基因组中,当今的艾滋病治疗只能达到“功能性”治愈,但不能彻底治愈。如需获得彻底根治,整合的潜伏病毒基因组就必须被完全根除。根据艾滋病病毒两端含有几乎对等的长重复序列的特点,研究人员利用了CRISPR/Cas9酶剪断长重复序列,便切除了其间的艾滋病病毒基因组,此后细胞可自我修复。结果使得巨噬细胞、小胶质细胞和T淋巴细胞等,均成功地根除了潜在的艾滋病病毒。此外,这种方法也有望应用于清除其他潜伏性感染病毒。

当然,CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足。首先,Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠向导RNA序列的匹配,在目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序,如果目标序列周围不存在这些基序或者无法严格配对,则Cas9蛋白不能对任意序列进行切割。最后,和ZFN及TALEN技术一样,CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。为此我们认为,正面应对关于CRISPR/Cas9技术的安全性和论理性的讨论不仅仅是满足社会舆论的呼吁,也是未来将该技术的应用纳入正常管理的需求。

作者:
南京大学模式动物研究所 黄新许教授
南京大学模式动物研究所 高 翔教授

本稿件为中国细胞生物学学会特邀原创稿件,转载请注明出处。